LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Acara 6
Menghitung dan Mengukur Sel
Nama : Muhammad Arif Abdullah Humam
NPM : E1J012004
Kelompok : 1 (Satu)
Jadwal Praktikum : Senin, Shift 4 (14.00-15.40)
Dosen Pembimbing : Dr. Ir. Tunjung Pamekas, M.Sc.
Coach : Fretty Aritonang
Laboratorium Ilmu Hama dan Penyakit Tanaman
Fakultas Pertanian
Universitas Bengkulu
2013
⦁ Tujuan Praktikum
⦁ Mahasiswa dapat menghitung spora dengan menggunakan haemocytometer.⦁ Mahasiswa dapat menghitung jumlah spora dan sel menggunakan Skala micrometer okuler (SMOK) dan Skala micrometer obyektif (SMOB).
⦁ Dasar Teori
Mikrobiologi adalah suatu cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang mikroorganisme dan interaksi mereka dengan organisme lain dan lingkungannya. (Singleton.2006)
Sejarah tentang mikroba dimulai dengan ditemukannya mikroskop oleh Leeuwenhoek (1633-1723). Mikroskop temuan tersebut masih sangat sederhana, dilengkapi satu lensa dengan jarak fokus yang sangat pendek, tetapi dapat menghasilkan bayangan jelas yang perbesarannya antara 50-300 kali. (Skou, dan Sogaard Jensen. 2007)
Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk bertahan hidup. Jasad tersebut dapat hidup hamper di semua tempat di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang relative panas, dari ligkungan yang asam hingga basa. Berdasarkan peranannya, mikroba dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu mikroba menguntungkan dan mikroba merugikan (Afriyanto 2005).
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum untuk memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung, perhitungan tidak langsung dan perkiraan tidak langsung (Harmita 2006).
Perhitungan langsung (direct count) untuk jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dan sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct measurement) untuk biomassa mikroorganisme, massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel, dan biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan pada kurva standar. Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel, mikroorganisme dalam sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, pertumbuhan mikroorganisme contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa mikroorganisme diperkirakan dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relative konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan dengan kurva standar (Harmita 2006).
Haemocytometer awalnya adalah perangkat yang dirancang untuk penghitungan sel darah. Sekarang juga digunakan untuk menghitung jenis sel serta partikel mikroskopis lainnya. Haemocytometer ini ditemukan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari tebal kaca slide mikroskop dengan lekukan persegi panjang yang menciptakan sebuah kamar. Ruang ini diukir dengan laser-terukir grid garis tegak lurus. Perangkat ini dibuat dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis diketahui, dan kedalaman ruang ini juga diketahui. Oleh karena itu mungkin untuk menghitung jumlah sel atau partikel dalam volume tertentu cairan, dan dengan demikian menghitung konsentrasi sel dalam cairan secara keseluruhan.(Wiki, 2013).
Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui, menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer objektif = 0,01 mm / 10 µm.
Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi. (Muslim, 2011).
⦁ Bahan dan Alat
⦁ Alat : 1unit haemocitometer, 1 buah jarum ent, 1 buah mikrometer objektif, 1 buah mikrometer okuler 1 buah gelas penutup, 1buah pipet tetes, 1 unit mikroskop.
⦁ Bahan : 25 ml suspense sel spora
⦁ Cara Kerja
⦁ Mengukur mikroorganisme
⦁ Gelas objek dibersihkan menggunakan alcohol 70% sampai bebas debu dan lemak, kemudian ditetesi aquades.
⦁ Massa sporangium diambil menggunakan jarum ent kemudian diletakkan didalam tetesan air di atas gelas obyek kemudian ditutup dengan gelas penuup dan dijaga agar tidak timbul gelembung udara.
⦁ Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran dimana obyek terlihat paling jelas.
⦁ Micrometer okuler dipasang dalam lensa okuler untuk mengukur obyek dengan menggunakan skala yang ada dalam micrometer okuler, dengan cara menggeser-geser meja benda pada mikroskop dam memutas lensa okuler sampai tepat pada obyek yang di ukur. Pada praktikan dilakukan pengukuran panjang dan lebar 3 sporangium.
⦁ Setelah selesai mengukur obyek dengan skala okuler, preparat diambil dari menja benda kemudian diganti dengan micrometer obyektif untuk kalibrasi skala micrometer. Harus diingat bahwa pembesaran lensa mikroskop yang digunakan hars sama antara pengukuran selnya.
⦁ Skala micrometer okuler (SMOK) diatur supaya berimpit dengan skala micrometer obyektif (SMOB), dengan cara menggeser-geser mejabenda pada mikroskop dan memutar lensa okuler.
⦁ Setelah garis skala masing-msing ada yang saling berimpit, dilakukan kalibrasi dengan cara membandingkan kesetaraan SMOK danSMOB, yaitu denganmenghitung jumlah SMOK dan jumlah SMOB.
⦁ Dalam praktikum kalibrasi atau penyetaraan dilakukan sebanyak 2 kali, kemudian dihitung ukuran sel menurut ukuran micrometer obyektif.
⦁ Menghitung mikroorganisme
⦁ Haemocitometer dibersihkan dengan menggunakan alcohol sampai benar-benar bersih, kemudian dikeringkan. Perlu diingat bahwa kotak pada haemocitometer ukurannya sangat kecil sehingga kemasukan satu butir debu saja sudah cukup menyumbat kotak.
⦁ Suspensi spora dikocok kemudian dipipet dan diteteskan pada haemocitometer tepat pada ruang hitungnya, sebanyak satu tetes.
⦁ Tetesan suspense ditutup menggunakan gelas penutup dan dijaga agartidak menjadi gelembung udara dala kotak-kotak haemocytometer.
⦁ Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop dan dihitung jumlah sel dalam setiap kotak. Jika antar kotak jumlahnya tidak seragam, ulangi langkah ke-2 (dikocok lagi)
⦁ Pada praktikum dihitung dari 5 kotak(ruang hitung), kemudian dirata-rata dan dihitung jumlah selnya setiap koloni.
⦁ Data Hasil Pengamatan
⦁ Mengukur sel
Obyek Ulangan SMOK
Mikrometer 1 34-46 = 12
2 30-34 = 4
3 30-32 = 2
Total 3 18
Rata-rata 18/3 = 6 SMOK
Obyek Ulangan SMOK SMOB Perbandingan
Mikrometer 1 40-80 = 40 21 21/40 = 0,525
2 10-100 = 90 19 19/90 = 0,21
Total 2 130 40 0,735
Rata-rata 130/2 = 65 40/2 = 20 0,735/2 = 0,37
⦁ Mengitung sel
Obyek Kotak kecil Jumlah sel
Sel spora mikoriza 1 6
2 5
3 6
4 8
5 5
Total 5 kotak 30
Rata-rata 30/5 = 6 sel
⦁ Hasil Perhitungan dan Pembahasan
⦁ Mengukur Sel
Pada percobaan ini, diawali dengan mengganti lensa okuler mikroskop dengan micrometer okuler, kemudian letakkan sebuah kaca objek ke meja preparat, lalu teteskan setetes suspensi yang berisi mikroba ke kaca objek, lalu menutupnya dengan kaca penutup. Setelah diamati, terdapat beberapa unit sel mikoriza didalam nya, kemudian diukur berdasarkan skala micrometer okuler (SMOK) yang terlihat langsung, pertama, didapat ukuran diameter sel sebesar 12 SMOK,kemudian diulangisampai 3 kali pengukuran, dan didapat hasil selanjutnya yaitu, 4 SMOK dan 2 SMOK. Kemudian hasilnya dirata-ratakan, yaitu (12+4+2)/3=18/3=6 SMOK. Karena SMOK tidak diketahui satuan umumnya, maka SMOK disesuaikan dengan Skala micrometer objektif (SMOB) dengan cara pengkalibrasian. Pengkalibrasian ini diawali dengan meletakkan micrometer objektif keatas meja preparat mikroskop(setelah dipastikan micrometer okuler tetap terpasang), kemudian melihat garis-garis pada kedua micrometer yang berhimpit dan mencatatnya, dilakukan 2 kali,pertama didapat hasil 40 SMOK = 21 SMOB. Maka, 1 SMOK = 21/40 SMOB = 0,525 SMOB. Kemudian hasil kalibrasi yang kedua ialah 90 SMOK = 19 SMOB. Sehingga, 1 SMOK = 19/90 SMOB = 0,21. Rata-rata hasil nya, 1 SMOK = (0,525+0,21)/2 = 0,735/2 = 0,3675 => 0,37 SMOB.
Langkah selanjutnya, diameter rata-rata sel dijadikan dalam SMOB, yaitu, 6 SMOK = 6x0,37 SMOB = 2,22 SMOB maka, jari-jari sel tersebut = ½ x 2,22 = 1,11. Kemudian, dihitung luas sel dengan cara menghitung luas lingkaran(karena pada pengamatan, sel berbentuk lingkaran), hasilnya => π.r2 = 3,14 x 1,11 x 1,11 = 3,87 SMOB2. 1 SMOB = 0,01 mm= 10µm, maka, 3,87 SMOB2 = 3,87.102µm2 = 387µm2 = 3,87.10-4mm2.
⦁ Menghitung Sel
Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Praktikum ini menggunakan perhitungan secara langsung. Penghitungan koloni secara langsung, dilakukan agar mengetahui secara langsung juga. Penghitungan ini belum tentu akurat, karena hanya berdasarkan pada mikroba yang ada. Mikroba yang ada pada media ataupun sampel yang terhitung tidak hanya mikroba yang hidup, mungkin saja mikroba yang mati juga terhitung.
Penghitungan ini menggunakan Haemocytometer. Alat ini memiliki ruang atau kamar-kamar yang nantinya menjadi Ruang hitung, terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm² . Satu kotak kecil luasnya 0,0025 mm2 = 25.10-4mm (terlihat pada Haemocytometer) . Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm=10-1mm . Sehingga, volume satu kotak kecil = 25.10-4mm2 x 10-1mm = 25.10-5mm3 = 0,00025mm3. Sel spora yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah spora per satuan volume dapat diketahui.
Setelah dipastikan alat ini steril, kaca penutup diletakkan di atas Haemocytometer. Peletakkan ini beguna dalam menjaga mikroba yang akan dihitung pada ruang alat tetap bentuknya dan tidak terkontaminasi. Kemudian suspensi diteteskan sekali dengan pipet tetes. Suspensi ini akan bergerak mengalir ke permukaan alat dan akan mengisi ruang alat ini. Ruang yang terisi dengan mikroba pada yang terletak pada ruang atau kotak kecil dapat langsung dihitung dengan menghitung jumlah sel pada masing-masing kotak kecil, lalu ditentukan rata-ratanya. Hasil perhitungan kemudian dibandingkan dengan volume suspense.
Hasil praktikum memperoleh bahwa jumlah mikroba dalam suspensi ini pada kotak kecil yang ke-1 terdapat 6 sel, kotak-2 ada 5 sel, kotak-3 ada 6 sel, kotak-4 ada 8 sel, dan kotak-5 ada 5 sel, tak ditemukan sel pada kotak lainnya, sehingga didapat rata-rata sel ialah sel. Kemudian, dihitung jumlah sel per mm3 nya, yaitu 24.000 sel/mm3. Jadi, dalam 1mm3 suspensi, ter dapat 24.000 sel, namun, apabila dikonversi dalam satuan mL (cm3) = 10mmx10mmx10mmx24000sel = 2,4.107 sel/mL sehingga, dapat diduga bahwa dalam 25mL suspensi tersebut terdapat => 25 mL x 24.107sel/mL = 6.108 sel(600juta sel).
⦁ Kesimpulan
⦁ Mengukur sel mikroba secara langsung belum tentu akurat, karena dapat terjadi kesalahan dalam pengamatan dan penghitungan ukuran sel dandalam melakukan kalibrasi skala micrometer.
⦁ Menghitung sel mikroba secara langsung menggunakan Haemocytometer juga belum tentu akurat, karena sel yang terlihat belum tentu sel yang hidup ataupun berhimpit, dan dalam penghitungan jumah sel pada masing-masing kotak kecil dapat terjadi kesalahan, sehingga jumlah sel sebenarnya belum tentu sesuai dengan yang ada pada pengamatan, hanya mendekati.
⦁ Semakin tinggi perbesaran mikroskop, semakin teliti pengukuran dan penghitungan, karena dapat memisahkan sel yang berhimpit, sehingga, dapat memperkecil resiko kesalahan dalam pengukuran maupun penghitungan.
Daftar Bacaan
Afriyanto,Eddy. Pakan Ikan dan Perkembangannya. 2005. Penerbit Kanisius. Jakarta
Harmita. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi Ketiga. 2006. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta
Muslim, Ahmadi. Menghitung jumlah bakteri. file:///X:/menghitung-perhitungan-jumlah-bakteri_26.html. Diakses pada tanggal 24 April 2013.
Purnomo, Bambang Ir MP. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. 2013. Laboratorium Ilmu Hama dan Penyakit Tanaman Universitas Bengkulu. Bengkulu
Singleton,Paul. Dictionary of Microbiology And Molecular Biology Third Edition.2006. John wiley & Sons Inc. England
Skou Torben dan Sogaard Jensen Gunnar. Microbiology.2007. Forfattern Og Systime. England
Wikipedia. Hemocytometer. http://id.wikipedia.org/wiki/Hemocytometer. 2013. Diakses pada tanggal 24 April 2013.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar